DNA-Sequenzierung: Kettenabbruchverfahren & Gelelektrophorese

​​Das Wichtigste in Kürze

Die DNA-Sequenzierung ist ein Prozess, um die Basenabfolge eines DNA-Abschnitts zu ermitteln. Dabei gibt es verschiedene Sequenzierungstechniken, welche jedoch fast alle nach dem gleichen Grundprinzip funktionieren (Ausnahme Nanopore, PacBio). Um die Sequenz einer DNA aufzuklären, benutzt man die Komplementarität der DNA. Das heisst, dass jede Base eine komplementäre Base hat, die in einem DNA-Doppelstrang an sie bindet (Adenin-Thymin, Guanin-Cytosin). 

Wichtige Begriffe

• Desoxynukleotide: Die Desoxynukleosidtriphosphate sind Bausteine für die DNA. Sie werden sie als dNTPs abgekürzt. (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
  
• Didesoxynukleotide: Abgekürzt: ddNTPs. Diese Nukleotide sind chemisch bis auf einen Unterschied exakt gleich wie die 4 dNTPS. Ihnen fehlt jedoch die Alkoholgruppe am C3 Kohlenstoff. Baut die DNA-Polymerase solch ein Nukleotid in die wachsende DNA-Kette ein, so kann sie nicht mehr weiterwachsen.
  
• Gelelektrophorese: Verfahren, um verschieden lange DNA Ketten aufzuteilen. Dabei werden die Ketten in den Anfang eines Acrylamidgelblocks gegeben, und dann wird ein elektrisches Feld angewendet. Da die DNA-Fragmente negativ geladen sind, beginnen sie durch das Gel zu wandern. Die kurzen Ketten wandern weit, während längere Ketten nicht so weit wandern. Nach einer Weile sind alle Fragmente der Länge nach im Gel-Block angeordnet. 

​Den Arbeitsfluss lässt sich am einfachsten mit der "Sanger-Sequenzierungsmethode" erklären. Diese Methode ist eine der ältesten Sequenzierungstechniken, jedoch ist sie sehr genau und wird auch heute noch verwendet. Schau dir die Grafiken gut an, um das Prinzip zu verstehen. Grob lässt sie sich die Sequenzierung in 2 separate Arbeitsschritte unterteilen:

Kettenabbruchverfahren der Sanger-Sequenzierung

1. Die DNA, deren Sequenz du wissen willst, wird mittels einer PCR vervielfacht, um viele DNA Stränge zu erhalten.
2. Die erhaltenen DNA-Kopien werden erhitzt, um sie in Einzelstränge aufzuteilen.
3. Die Einzelstränge werden zusammen mit den vier DNA-Nucleotiden, Primern und DNA Polymerasen in vier separate Mischungen aufgeteilt.
4. Zusätzlich zu den 4 normalen dNTPs wird pro Mischung je ein Typ der ddNTPs gegeben. 
5. Die DNA-Polymerase beginnt komplementäre Stränge der gesuchten Sequenz zu bilden.
6. Da die Konzentration der dNTPs viel höher als die der ddNTPs ist, wachsen die komplementären Ketten. Zufällig wird trotzdem manchmal ein komplementäres ddNTP eingebaut. Ist dies der Fall, so hört diese Kette auf zu wachsen. Durch diesen Effekt entstehen ganz viele verschieden lange Ketten. Die Sequenz der Ketten ist noch unbekannt, aber du kannst die jetzt schon sicher sein, dass die letzte Base der Kette die Base sein muss, deren ddNTP du zu der jeweiligen Mischung gegeben hast. Also zum Beispiel enden alle erhaltenen Ketten aus der Mischung mit ddATP mit Adenin.

Gelelektrophorese

1. Die vier Mischungen werden separat in eine Tasche des Gel-Blocks pipettiert.
2. Dann wird eine Gelelektrophorese durchgeführt, bis alle Ketten sich der Länge nach angeordnet haben. Dabei entspricht jeder Schritt zur nächsten Kette jemals einer Verlängerung von je 1 Nukleotid.
3. Du weisst ja nun, welche Ketten in deinem Gel mit welcher Base enden. Mithilfe von Fluoreszenz oder Radioaktivität wird das Aufteilungsmuster sichtbar gemacht.
4. Jetzt bleibt nur noch abzulesen, ist das finale Muster so wie in der Grafik, dann wäre die Sequenz der gesuchten DNA Sequenz:  XXXXXXXXXXX. Also genau die komplementäre Sequenz zum abgelesenen Muster

Moderne Sequenzierungsmethoden

Die Sanger Methode ist zwar sehr genau, aber auch super zeitaufwendig und dadurch teuer. Sie gehört zusammen mit der Maxam-Gilbert Methode zu der 1. Generation der Sequenzierungsmethoden. Die Methoden wurden in den letzten Jahren jedoch immer vielfältiger, schneller und billiger, sodass man heutzutage je nach Zweck andere Methoden verwendet. Meistens verwendet man heute Methoden der 2. Generation, in denen die Arbeitsschritte parallelisiert sind (zum Beispiel Illumina), jedoch funktionieren auch diese Methoden nach dem Grundprinzip des Kettenabbruchverfahrens. 

Noch neuere Methoden der 3. Generation wie Nanopore oder PacBio basieren nicht mehr auf diesem Verfahren. In diesen muss die DNA weder vervielfältigt werden, noch wird eine Kette mit ddNTPs abgebrochen. Sie sind sehr schnell und billig, aber auch noch relativ ungenau, weshalb alle Generationen an Sequenzierungsmethoden noch verwendet werden.