Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) gehört zu den Standardverfahren in biologischen Laboren, um DNA zu vervielfältigen. Die PCR ermöglicht es, mit nur wenig Ausgangs-DNA massenhaft DNA-Kopien herzustellen, um Untersuchungen am jeweiligen genetischen Material zu unternehmen. Die PCR wird in Verfahren zur Aufklärung von Verbrechen (genetischer Fingerabdruck), Diagnose von Erbkrankheiten, Virusinfektionen und Erforschung von Familienverhältnissen (Stammbaumanalysen) angewendet. Die Bezeichnung PCR bezieht sich auf das Enzym Polymerase, das eine ausschlaggebende Rolle in der DNA-Replikation spielt. Das Verfahren wird als Kettenreaktion bezeichnet, da die Vervielfältigung von DNA durch den Ablauf mehrerer Zyklen derselben Prozedur erfolgt, dabei dient das Ausgangsprodukt eines Zyklus für die Folgereaktion und den Beginn eines neuen Zyklus.
Tipp: Schau Dir nochmal das Thema DNA-Replikation an
Ablauf einer PCR
Vorbereitung
Die PCR ist ein temperaturabhängiges Verfahren, das in einem Heizblock (Thermocycler) stattfindet. Die DNA, Polymerase, freie Nukleotide und Primer werden als Reaktionsmix zusammengestellt und in einem kleinen Plastikgefäss in den Thermocycler gestellt. Beim Ablauf der PCR werden die unterschiedlichen Bestandteile des Reaktionsmix durch spezifische Temperaturen abwechselnd aktiviert und inaktiviert. Der Thermocycler kann die Temperaturen den unterschiedlichen Schritten zur DNA-Vervielfältigung automatisch anpassen.
Ablauf eines PCR-Runs
Das PCR-Verfahren kann in 3 Hauptschritten zusammengefasst werden.
Für die Primer-Anlagerung müssen im Vorfeld komplementäre Primer für die 3'-Enden der beiden DNA-Einzelstränge synthetisch hergestellt werden. Dafür muss die Basensequenz der 3'-Enden beider DNA-Einzelstränge bekannt sein (DNA-Sequenzierung). Die Polymerase, die im dritten Schritt verwendet wird, stammt aus einem Bakterium und ist hitzestabil (Taq-Polymerase). Nach dem Syntheseschritt wird die Temperatur kurz erhöht, damit sich die Polymerase löst. Darauf folgt wieder eine Absenkung der Temperatur und ein neuer PCR-Zyklus startet. Ein PCR-Zyklus wird auch oft als Run bezeichnet.
Ablauf
Schritt
Beschreibung
Temperatur
DNA-Denaturierung
Auflösung der Wasserstoffbrückenbindungen der Ausgangs-DNA durch Hitze, DNA liegt in zwei Einzelsträngen vor.
90°C
Anlagerung der Primer
Komplementäre Primer (20-25 Nukleotide) lagern sich an 3'-Enden der DNA-Einzelstränge an, Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Primern und DNA an passenden Stellen .
50−65°C
Synthese des DNA-Doppelstrangs
Freie Nukleotide aus dem Reaktionsmix werden durch die Taq-Polymerase an die 3'-Enden der Primer angelagert, Nukleotide werden zu einem DNA-Strang verknüpft, es liegt ein identischer DNA-Strang zur Ausgans-DNA vor.
70°C
Info
Die Vervielfältigung von DNA durch eine PCR verläuft exponentiell. Nach dem ersten Zyklus werden aus der Ausgangs-DNA zwei DNA-Kopien synthetisiert. Im zweiten Zyklus werden aus zwei DNA-Doppelsträngen vier und so weiter (8, 16, 32...). Nach 30 Zyklen (ca. 4 Std.) erhält man so mehr als 1 Mrd. Kopien des Ausgangsmaterials.
Erstelle ein Konto, um die Zusammenfassung zu lesen.
